Realtime PCR – tổng quan về kỹ thuật PCR và Realtime PCR

Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR là gì?

PCR là phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction). Trong kỹ thuật PCR, sau khi khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả và xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không bằng kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di), hoặc sử dụng thí nghiệm lai với các mẫu dò đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn phân tích sau khi khuếch đại còn gọi là kỹ thuật PCR cổ điển bằng việc sử dụng máy PCR, hay còn gọi là máy luân nhiệt.

Realtime PCR (Real time PCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR, chính vì vậy mà được gọi là real-time: thời gian thực, và do đặc điểm này mà với kỹ thuật Realtime PCR, người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch đại. Với kỹ thuật real-time PCR sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm là máy realtime pcr, sản phẩm cuối cùng của phản ứng được hiển thị ngay sau khi phản ứng khuếch đại hoàn tất. Vì vậy có thể nói Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được.

Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR:

Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR

Bạn cần tìm hiểu về đường nền (baseline), ngưỡng (threshold), chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct). Ngoài ra bạn cần tìm hiểu thêm về đường chuẩn (standard curve) và hệ số tương quan (R).

Đường nền (baseline): là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng từ chu kỳ 3 đến chu kỳ 15 và có thể được thay đổi.

Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền.

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng. Nói khác đi, đó là số chu kỳ của phản ứng realtime PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền.

Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR

Đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng. Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn.

Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao.

Hiệu suất của phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng.

Để cho kết quả chính xác nhất, bạn nên sử dụng máy realtime PCR chất lượng tốt.